Setelah lulus, ia bergabung dengan Kementerian Luar Negeri Indonesia. Dari tahun 1997 hingga 2001, Retno menjabat sebagai sekretaris satu bidang ekonomi di Kedutaan Besar Republik Indonesia di Den Haag, Belanda.Pada tahun 2001, ia ditunjuk sebagai Direktur Eropa dan Amerika.Retno dipromosikan menjadi Direktur Eropa Barat pada tahun 2003.
Pada tahun 2005, ia diangkat sebagai Duta Besar Indonesia untuk Norwegia dan Islandia. Selama masa tugasnya, ia memperoleh penghargaan Order of Merit dari Raja Norwegia pada Desember 2011, menjadikannya orang Indonesia pertama yang memperoleh penghargaan tersebut.Selain itu, ia juga sempat mendalami studi hak asasi manusia di Universitas Oslo. Sebelum masa baktinya selesai, Retno dikirim kembali ke Jakarta untuk menjadi Direktur Jenderal Eropa dan Amerika, yang bertanggung jawab mengawasi hubungan Indonesia dengan 82 negara di Eropa dan Amerika.
Retno kemudian dikirim sebagai Duta Besar Indonesia untuk Kerajaan Belanda pada tahun 2012. Ia juga pernah memimpin berbagai negosiasi multilateral dan konsultasi bilateral dengan Uni Eropa, ASEM (Asia-Europe Meeting) dan FEALAC (Forum for East Asia-Latin America Cooperation).
Pada 2017, Retno mendapatkan penghargaan sebagai agen perubahan di bidang Kesetaraan Gender dan Pemberdayaan Perempuan. Penghargaan tersebut diberikan oleh UN Women dan Partnership Global Forum (PGF). UN Women adalah lembaga PBB yang bertugas memajukan kesetaraan gender dan pemberdayaan perempuan. Sementara PGF adalah lembaga non-profit yang bertujuan memajukan kemitraan inovatif bagi pembangunan. Penghargaan ini diserahkan oleh Asisten Sekretaris Jenderal PBB yang juga selaku Deputi Direktur Eksekutif UN Women Lakhsmi Puri pada acara jamuan makan siang di sela pelaksanaan Sidang Majelis Umum PBB ke-72 di Markas Besar PBB, New York.Retno menikah dengan Agus Marsudi, seorang arsitek, dan dikaruniai dua orang anak, yaitu Dyota Marsudi dan Bagas Marsudi.
